바이오촉매 기술을 통한 의약용 D-트레오닌 생산 기술 개발
바이오촉매 기술을 통한 의약용 D-트레오닌 생산 기술 개발
  • 이웃집과학자
  • 승인 2021.06.22 00:38
  • 조회수 2185
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국내 연구진이 고순도 의약용 D-트레오닌을 대량 생산하는 인공 효소 및 반응공정 신기술을 개발했습니다. 해당 연구진은 저온 생육이 가능한 해양 유래 미생물에서 저온에서도 높은 활성을 나타내는 D-트레오닌 합성효소를 발굴하고, 저가의 원료물질인 글리신(glycine)과 아세트알데히드(acetaldehyde)로 고순도 D-트레오닌(threonine)을 제조했는데요. 본 기술은 항생제 의약품 원료 등에도 사용될 수 있을 것으로 기대됩니다.

연구팀 비대면 회의 화면 캡쳐
연구팀 비대면 회의 화면 캡쳐

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명硏) 합성생물학전문연구단 이승구․염수진(現 전남대 생명과학기술학부)박사팀과 경북대학교 생명과학부 김경진 교수팀은 해당 효소의 발굴, 구조 규명, 입체특이성 개량, 반응공정 구축을 공동 진행하여 D-트레오닌을 고순도로 대량 생산(99%, >50g/L)했습니다. 이 연구는 한국연구재단의 C1 가스 리파이너리 사업, 기초연구사업, 한국생명공학연구원 합성생물학전문연구단 사업으로 수행되었습니다. 결과는 촉매분야의 저명 저널인 미국화학회 전문학술지 (ACS catalysis, IF=12.35) 5월 28일자 온라인 판에 게재(교신저자: 김경진/이승구/염수진 교수, 제1저자: 박성현 UST 석박통합과정, 서호균 포항 가속기 연구소 Post Doc)되었습니다. 한국생명공학연구원은 D-트레오닌의 입체특이적 생산방법에 대한 특허를 ㈜엠에이치투바이오케미칼에 기술 이전하였으며 연내 시제품 개발을 추진하고 있습니다.

논문명 : Cβ-selective aldol addition of D-threonine aldolase by spatial constraint of aldehyde binding

 

이 연구는 고순도 항생제 원료의 경제적 생산을 위한 신규 D-트레오닌 합성효소를 개발할 목적으로 시작되었습니다. 기존 화학적 방법으로는 입체특이적 합성*이 어려우며, 자연에서 D-트레오닌 합성효소들이 발견되지만 역시 이성질체 부산물을 생성하는 문제가 있었는데요. 생명(연)-경북대-전남대 공동연구팀은 자연 효소의 핵심 활성부위 구조를 규명하고 단백질공학 연구를 통해 99.9% 의 고순도로 D-트레오닌을 합성하는 신규 인공효소를 개발했습니다. 또한 생명(연) 연구팀은 개량된 효소를 적용한 유가식 반응기를 개발하고 불안정한 기질을 연속 주입하여 6시간 내에 50g/L 이상의 D-트레오닌을 고순도로 생산하는 데 성공했습니다. 이 효소는 유사 구조의 다양한 의약품 원료의 입체특이적 생산에 적용될 수 있을 것으로 보고 있습니다.

* 입체특이적 합성 (Asymmetric synthesis) :  의약품 원료에 포함된 이성질체(분자식은 같으나 상대적 배열이 달라, 다른 입체·광학적 성질을 갖는 화합물) 불순물은 제거하기 매우 어려우며 심각한 부작용(side effect)의 원인이 됨. 이성질체 중 하나의 성분만을 특이적으로 합성하는 생물학적 방법(입체 특이적 합성)을 개발하면 고순도 의약원료를 경제적으로 확보할 수 있음.

생명연 합성생물학전문연구단 이승구 단장은 “인공 효소를 이용한 의약품원료의 친환경 고순도 합성은 화이트 바이오텍(white biotechnology)으로 지칭되며 지속 가능한 정밀화학 및 제약산업을 위한 핵심 이슈이다.”며, “본 연구는 구조기반의 인공 효소개발 및 반응공정 연구가 의약 및 화학산업의 고도화에 기여할 수 있음을 보여주는 사례이며, 향후 합성생물학 발전에 따라서 효소를 이용한 고부가가치 물질 합성이 더욱 가속화될 것으로 기대된다.”고 밝혔습니다.


연구결과개요

연구배경

  • L-아미노산은 미생물 발효를 통하여 대량 생산되며 식품, 사료, 조미료 등에서 큰 세계시장을 형성하고 있고 우리나라는 라이신, 트립토판, 메치오닌 등에서 세계 최대 제조국의 하나이다. D-아미노산은 항생제, 치료제, 인공펩타이드 등의 고부가가치 원료로 이용되며, 이들을 고순도로 생산하는 기술은 정밀화학 및 바이오산업의 지속적인 관심을 모아왔다. 하지만 베타-히드록시-알파-아미노산은 키랄 탄소가 두 가지로 총 네 개의 이성질체가 존재하여 기존 화학적 합성방법으로 고순도 합성이 어렵고 생물학적 생산법도 정립되어 있지 않다.
  • 기존 화학적 합성법에는 다단계 반응으로 효율이 낮고, 과량의 유기용매 사용에 따른 환경부담이 크다. 반면 효소적 합성법을 개발하면 단일 반응이 가능하며 유기용매 사용을 최소화할 수 있고, 반복 재사용이 기대되었다. 이에 본 연구에서는 트레오닌 합성효소(Threonine aldolase)를 개발하여 의약용 베타-히드록시-알파-아미노산을 입체특이적으로 합성하는 기술을 개발하고자 하였다.
  • 이 효소는 기본적으로 각각 탄소 2개로 구성되는 글리신과 아세트알데히드를 기질로 이용하여 탄소 4개인 트레오닌을 합성하는 효소로서, L-형과 D-형의 아미노산을 입체특이적으로 생성할 수 있고, 다양한 베타-히드록시-알파-아미노산을 생성할 수 있다는 특징이 있다. 하지만 기존 효소들은 생성물의 베타 탄소에 입체선택성이 낮아 두 가지 이성질체(syn-, anti-형) 를 모두 생성하는 단점이 있다.

연구내용

  • 생명硏 및 경북대학교 연구팀에서는 기존 D-트레오닌 합성효소가 기본 생성물인 트레오닌에 낮은 활성과 낮은 입체선택성을 나타낸다는 것에 주목하여, 기존 효소들과 비교하여 낮은 아미노산 상동성을 가지는 잠정적인 D-트레오닌 합성효소 서열들을 확보하였고, 그 중 D-트레오닌에 대해 고활성과 높은 입체선택성을 가지는 진정한 의미의 D-트레오닌 합성효소를 찾아내었다.
  • 기존 보고된 D-트레오닌 합성효소(D-Threonine aldolase)의 효소구조를 기반으로, 본 연구에서 확보한 신규 D-트레오닌 합성효소의 구조 규명과 물리적 모델 분석을 진행하였다. 기질과 생성물의 방향성에 영향을 줄 수 있는 잔기를 확인하였고, 효소 공학 연구를 통해 실제 입체선택성이 99.9% 까지 향상된 결과를 얻을 수 있었다.
  • 기존 연구들에서 D-트레오닌 합성효소는 가역반응이 가능하기 때문에, 장시간 반응했을 때, 입체선택성이 감소한다고 보고되어 있다. 하지만, 개량된 효소는 장시간 반응 시에도 입체선택성에 큰 변화가 없었고, 이는 생산 공정의 적용에 상당한 이점을 가진다.
  • 해당 연구진은 확보한 개량 효소를 소형 발효조에서 반응시켜 실제 산업적 적용이 가능함을 보여주었다. 반응에 이용되는 기질 중 하나인 아세트알데히드는 휘발성과 불안정성, 효소 독성을 나타내므로, 발효조를 밀폐시키고 기질의 투입 조건을 최적화하여 6시간 반응 만에 50g/L 이상의 D-트레오닌이 97% 이상의 순도로 생성되는 것을 확인하였다. 반응 조건은 더 최적화될 여지가 있다.
  • 또한, 개량 효소는 D-트레오닌 뿐만 아니라, 다른 베타-히드록시-알파-아미노산에도 입체선택성을 향상시키는 결과를 보여주었다. 이러한 결과들은 해당 효소가 베타-히드록시-알파-아미노산의 입체특이적 생산에도 적용될 수 있음을 보여주는 것이다.
그림1.  신규 효소 탐색과 활성 및 입체선택성 확인A)는 신규 D-트레오닌 합성효소를 탐색하기 위해 기존 D-트레오닌 합성효소와의 아미노산 서열 상동성을 기반으로 효소 계통수를 도식화 한 것이다. B,C) 얻어진 신규 D-트레오닌 합성효소들의 pH별 활성과 입체특이성을 비교함으로써, 고활성, 높은 입체선택성을 갖는 효소를 발굴하였다. D,E,F) 고활성 및 높은 입체선택성을 갖는 효소의 최대 활성을 확인하기 위해 온도와 보조인자의 종류 및 농도별에 대한 활성을 확인하였다.
그림1. 신규 효소 탐색과 활성 및 입체선택성 확인A)는 신규 D-트레오닌 합성효소를 탐색하기 위해 기존 D-트레오닌 합성효소와의 아미노산 서열 상동성을 기반으로 효소 계통수를 도식화 한 것이다. B,C) 얻어진 신규 D-트레오닌 합성효소들의 pH별 활성과 입체특이성을 비교함으로써, 고활성, 높은 입체선택성을 갖는 효소를 발굴하였다. D,E,F) 고활성 및 높은 입체선택성을 갖는 효소의 최대 활성을 확인하기 위해 온도와 보조인자의 종류 및 농도별에 대한 활성을 확인하였다.
그림 2. 신규 D-트레오닌 합성효소의 구조 기반의 효소 개량 연구A,B)는 신규 D-트레오닌 합성효소의 구조를 분석하고, 효소의 활성부위 내에서 기질의 입체선택성에 영향을 줄 수 있는 잔기들을 선별하였다. C,D)는 선별한 잔기들의 아미노산 치환을 통해 활성과 입체선택성의 변화를 측정한 결과이다.
그림 2. 신규 D-트레오닌 합성효소의 구조 기반의 효소 개량 연구A,B)는 신규 D-트레오닌 합성효소의 구조를 분석하고, 효소의 활성부위 내에서 기질의 입체선택성에 영향을 줄 수 있는 잔기들을 선별하였다. C,D)는 선별한 잔기들의 아미노산 치환을 통해 활성과 입체선택성의 변화를 측정한 결과이다.
그림 3. D-트레오닌 합성효소의 입체특이성 향상 관련 잔기 확인과 반응시간에 따른 입체선택성 변화A)는 선별된 잔기들의 추가 개량과 입체특이성 변화 및 활성을 나타낸 것이다. B)는 다른 D-트레오닌 합성효소들에서도 해당 잔기를 동일하게 치환하였을 때, 입체선택성이 증가된 결과이다. C,D,E,F,G,H) 야생형과 개량 효소의 반응시간별 입체특이성 변화를 나타낸 것이다.
그림 3. D-트레오닌 합성효소의 입체특이성 향상 관련 잔기 확인과 반응시간에 따른 입체선택성 변화A)는 선별된 잔기들의 추가 개량과 입체특이성 변화 및 활성을 나타낸 것이다. B)는 다른 D-트레오닌 합성효소들에서도 해당 잔기를 동일하게 치환하였을 때, 입체선택성이 증가된 결과이다. C,D,E,F,G,H) 야생형과 개량 효소의 반응시간별 입체특이성 변화를 나타낸 것이다.
그림 4. 개량 효소를 이용한 고순도 D-트레오닌 생산A)는 D-트레오닌 생산을 위한 반응기 모식도이다. B)는 A와 같이 설치된 반응기에서 기질인 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌이 생산되는 것을 시간별로 측정한 결과이다.
그림 4. 개량 효소를 이용한 고순도 D-트레오닌 생산A)는 D-트레오닌 생산을 위한 반응기 모식도이다. B)는 A와 같이 설치된 반응기에서 기질인 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌이 생산되는 것을 시간별로 측정한 결과이다.

연구성과의 의미 

  • 기존 화학 기술로 합성이 어려운 정밀화학물질의 입체특이적 합성 이슈를 바이오기술(구조규명, 효소공학, 생물반응기연구)로 통하여 해결한 사례
  • 본 연구는 효소 탐색과 개량 그리고 구조생물학적 이해를 바탕으로 한 화이트 바이오테크가 기존 화학 기술의 단점을 극복하는 효과적 방법이 될 수 있음을 보여준다. 
  • 최근 합성생물학 분야는 바이오 기술의 적용 속도와 적용 규모를 급속하게 확대하고 있으며, 이렇게 도출된 유의미한 결과들로 기존 미생물 및 효소로는 어려웠던 새로운 바이오 공정의 개발이나 산업적 가치 창출도 가능할 것으로 기대된다. 

용어설명

1. 입체특이적 합성 (Asymmetric synthesis)

이성질체 의약 원료는 역사적으로 심각한 부작용 (side effect)의 원인이 되기도 하였다. 인공 효소를 이용한 생물학적 합성은 이성질체 중 하나의 성분만을 특이적으로 합성할 수 있으며 화학적 방법대비 생물학적 합성법의 장점을 설명하는 가지 주된 특성이라 할 수 있다

2. 이성질체 (Isomer)

분자식과 물리/화학적 성질이 같으나, 상대적인 배열이 달라서 다른 입체·광학적 성질을 갖게 된다.

3. 구조생물학 (Structural biology)

모든 생명현상을 물리적 지배하에 있는 물질로써 설명하고자 하는 학문으로, 현대 생물학의 중심이 된 분자생물학의 핵심 관점을 다루고 있다. 대사산물과 유전체의 DNA를 비롯하여 생명활동기능을 수행하는 고분자 단백질에 이르기까지 생명체의 근간을 이루는 분자들의 구조와 이들의 작용 원리 및 상호작용을 해석하고자 한다.

4. 효소공학 (Enzyme engineering)

생명체가 분자 화합물을 자유자재로 변형시키기 위하여 이용하는 단백질을 효소라고 하며, 이러한 효소의 성능을 인공적으로 향상시키기 위해 사용되는 기법이다. 일반적으로 방향진화 또는 구조적 정보를 이용하여 효소 단백질을 이루는 아미노산 서열을 변경하는데, 이는 자연에 존재하지 않던 새롭고 강력한 효소를 만들어낼 수 있다.


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