KAIST(총장 이광형)는 생명화학공학과 이상엽 특훈교수와 물리학과 박용근 석좌교수 공동연구팀이 ‘3차원 홀로그래픽 현미경 기술을 통한 미생물의 바이오 플라스틱 과립 생산 특징 규명’에 성공했다고 27일 밝혔습니다. 이번 연구 결과는 국제 학술지인 ‘미국국립과학원회보(PNAS)'에 7월 27일 字 온라인 게재됐는데요.
논문명 : Three-dimensional label-free visualization and quantification of polyhydroxyalkanoates in individual bacterial cell in its native state
전 세계적으로 폐플라스틱으로 인한 환경오염 및 생태계 파괴, 미세 플라스틱의 인류 보건 위협 등의 문제가 심각해짐에 따라 다양한 규제 및 대안 기술들이 연구되고 있습니다. 그중 미생물로부터 만들어지는 폴리에스테르인 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate, 이하 PHA)가 기존 합성 플라스틱을 대체할 친환경 바이오 플라스틱으로 많은 관심을 받고 있습니다.
PHA는 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌과 같은 범용 플라스틱과 유사한 물성을 가지고 있어 용기 포장재, 비닐, 일회용품 등의 다양한 활용이 가능하며, 토양이나 해양 환경에서 생분해가 가능한 고분자라는 가장 중요한 장점을 갖고 있습니다.
PHA는 몇몇 미생물 내에 불용성의 과립(granule) 형태로 발견되는 고분자 물질로, 미생물이 환경 변화 및 세포 상태에 따라 탄소원, 에너지원으로 세포 내에 축적하게 되는데요. PHA가 세포 내에 축적되는 원리를 관찰하기 위해 여러 연구가 진행돼왔습니다.
형광 현미경, 투과전자현미경, 전자 저온 촬영 등의 기술이 이용됐는데, 이는 2차원상의 이미지만을 제시하거나 형광 물질과 같은 별도의 표식이나 세포의 고정/절편 제작 과정이 있어야 하여, 세포 원래 그대로의 상태에서의 관측이 어려웠습니다. 따라서 기술적 한계로 인해 세포 내에서 PHA 과립 형성에 대한 완전한 이해가 어려웠고, 관측 결과에 기반을 둔 여러 형성 메커니즘 모델만이 제안됐었습니다.
이에 KAIST 이상엽 특훈교수와 박용근 석좌교수 공동연구팀은 최근 떠오르고 있는 3차원 홀로그래픽 현미경 기술을 통해 PHA 생산 박테리아의 심층 관찰 및 정량/정성 분석 연구를 수행했습니다. 3차원 홀로그래픽 현미경 기술은 물질의 굴절률(refractive index)을 활용하는 이미징 방법으로, 염색 등 준비 과정을 필요로 하지 않기 때문에 살아 있는 세포의 3차원 정보를 정량적으로 측정 가능합니다.
연구팀은 PHA의 한 종류인 PHB 생산 미생물로 잘 알려진 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)와 이 미생물의 PHB 합성 대사회로 유전자를 가진 재조합 대장균을 이용해 비교·분석을 수행했습니다. PHA는 현재까지 약 150여 가지의 하이드록시산 화합물들이 단량체로 보고되었으며, PHA 중 가장 대표적이며 많은 연구가 이루어진 것이 poly(3-hydroxybutyrate) [PHB]입니다.
연구팀은 재구성된 세포의 3차원 굴절률 분포로 단일세포 수준에서 세포와 세포 내 과립의 3차원 시각화 및 이를 통한 부피, 질량, 밀도, 분포 등의 정량 분석에 성공했습니다. 수백 개의 단일 세포들과 세포 내의 PHA 과립에 대한 정량 및 이의 통계 분석을 통해 두 미생물에서의 PHA 과립 형성의 차이점을 도출해냈습니다.
특히, 단일세포 내의 PHA 과립의 밀도의 개념을 새롭게 제시했으며, 두 미생물에서의 PHA 과립의 밀도의 차이 및 세포 내 분포 형태 및 위치에 대한 특이적인 차이를 발견했습니다. 더 나아가서, 두 미생물의 PHA 과립 형성의 차이를 나타내게 하는 핵심 단백질을 규명해, 재조합 대장균의 PHA 과립 형성의 양상을 쿠프리아비두스 네카토르와 유사하게 변화시킬 수 있었습니다.
또한, 실시간 모니터링을 통해 최대 약 8시간 동안의 세포와 세포 내 PHA 과립의 성장 과정을 보여주는 3차원 영상을 제작할 수 있었는데요. 이는 미생물이 살아있는 상태에서 별도의 처리 과정이 없는 자연 상태 조건 하에, 세포 내 PHA 과립의 형성과 세포 분열과 연계된 이동을 3차원에서 실시간으로 관측한 세계 최초의 결과라는 데 큰 의의가 있습니다.
KAIST 이상엽 특훈교수는 “이번 연구를 통해 미생물의 PHA 생산 원리에 대해 더욱 깊은 이해가 가능해졌고, 이는 생물학과 물리학의 융합 연구로서 이뤄진 성과라는 데에 큰 의의가 있으며, 향후 다양한 바이오 플라스틱 생산 공정 개발에 큰 도움이 될 것”이라고 말했습니다.
용어설명
1. 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate, PHA)
몇몇 미생물이 질소, 인, 황 등과 같이 특정 영양분이 부족하여 세포 성장에 적합하지 않은 환경에서 잉여 탄소원을 에너지원, 탄소원으로 축적해두는 목적으로 만들어지는 폴리에스테르 고분자 물질이다. 바이오기반 생산 및 생분해성의 고분자로, 석유 자원 유래 플라스틱을 대체할 바이오 플라스틱으로 주목받고 있다.
현재까지 약 150여 가지의 hydroxyacid (하이드록시산) 화합물들이 PHA 단량체로 보고되었는데, 단량체 종류 및 조성에 따라 고분자의 물성이 달라지므로 다양한 활용이 기대되는 고분자이다. 대표적으로 poly(3-hydroxybutyrate) [PHB], poly(4-hydroxybutyrate) [P4HB], poly(3-hydroxybutyrate-co-MCL-3-hydroxyacid)* 가 많이 사용되고 있다.
*MCL, medium-chain-length; 탄소길이 6-14개의 화합물을 의미함
2. PHA 과립 (PHA granule)
PHA는 박테리아의 세포질 내에 불용성의 과립 형태로 발견되는데, 과립 표면에 PHA 합성효소와 분해 효소 (PHA synthase, PHA depolymerase), 조절 효소 등의 여러 효소 및 단백질 (PhaP, PhaM)들이 붙어 작용하고 있다고 알려져 있다. 이러한 다양한 유기적인 작용에 의해 박테리아는 환경 변화 및 세포 상태에 따라 PHA를 합성하거나 분해할 수 있다.
3. 3차원 홀로그래픽 현미경 (광회절 단층 촬영 기술)
세포에 빛을 다양한 각도로 입사시켜 측정한 여러 장의 2차원 홀로그램으로부터 산란된 빛의 정보를 추출한 뒤, 푸리에 회절 원리를 바탕으로 한 복원 알고리즘을 이용하여 세포의 3차원 굴절률 분포를 재구성하는 방법이다. 세포에 외인성의 표지나 특별한 고정 방식을 사용할 필요가 없어, 세포를 살아있는 상태에서 실시간으로 관찰하는 것이 가능하다.
