타미플루 내성 바이러스, 고감도 나노센서로 직접 검출한다
타미플루 내성 바이러스, 고감도 나노센서로 직접 검출한다
  • 이웃집과학자
  • 승인 2021.06.17 12:00
  • 조회수 3013
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국내 연구진이 타미플루 내성 바이러스* 표면에 높은 선택도로 결합하는 항체를 선별하고, 이를 나노 구조체 기반 바이오 센싱 기술 중 하나인 SERS**에 적용하여 타미플루 내성 바이러스를 전처리 없이 직접 검출할 수 있는 면역 분석법을 개발했습니다. 해당 분석법은 다른 면역 분석법과 비교하여 10,000배 이상의 저농도의 타미플루 내성 바이러스도 직접 검출할 수 있는데요. 이 면역 분석법은 향후 타미플루 내성 바이러스 감염 여부를 간편하게 진단할 수 있게 하고 다양한 현장진단시스템에 활용될 것으로 기대가 되고 있습니다.

* 타미플루 내성 바이러스: ‘A/H1N1형 인플루엔자 바이러스(신종 인플루엔자)’ 중 항바이러스제인 Oseltamivir(상품명: 타미플루)에 치료 효과가 없는 내성 바이러스 

** SERS : Surface-Enhanced Raman Scattering, 나노구조체를 통해 바이오마커의 라만 신호 세기를 획기적으로 증가시켜 정밀한 질병 진단을 가능케 하는 광학 분석 기술

 

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 바이오나노연구센터 정주연, 강태준, 임은경 박사 연구팀(교신저자: 정주연/강태준/임은경, 제1저자: 김혜란/강현주)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부가 추진하는 글로벌프론티어사업 바이오나노헬스가드연구, 신진·중견연구자 지원사업, 바이오·의료기술개발사업의 지원으로 수행되었고, 생물공학 분야의 저명 저널인 바이오센서스앤바이오일렉스트로닉스(Biosensors and Bioelectronics, IF 10.257)에 5월 11일 온라인 판에 게재되었습니다. (논문명 : Development of 6E3 antibody-mediated SERS immunoassay for drug-resistant influenza virus)

 

2008년 세계보건기구(WHO)는 전 세계 41개국에서 타미플루로 치료해도 소용없는 약물 내성 신종플루 바이러스가 발생한 것을 보고 했는데요. 그 이후에도 타미플루 내성과 연관된 신종플루 바이러스의 변이가 급격히 증가하고 있습니다. 타미플루 내성 바이러스의 대부분은 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스로, 바이러스 표면에 있는 단백질(뉴라미니데이즈; Neuraminidase*)의 아미노산 하나가 변이된 돌연변입니다. 이 변이 바이러스는 타미플루 외의 약물에 내성을 갖는 신종플루 바이러스 변이 들과도 밀접한 연관성을 보입니다.

* 뉴라미니데이즈(Neuraminidase): 증식된 바이러스가 밖으로 배출되는 것을 돕는 ‘가위’ 역할을 하는 단백질 효소

그림 1. (A) 선별된 항체와 타미플루 감수성 바이러스(WT)와 내성 바이러스(H275Y)의 뉴라미니데이즈의 결합력 비교 (B) 선별된 항체와 다른 단백질과의 결합력 비교 (C) 일반 뉴라미니데이즈와 (D)H275Y-뉴라미니데이즈 변이에 대한 선별된 항체 간 결합자유에너지 모델링 분석결과
그림 1. (A) 선별된 항체와 타미플루 감수성 바이러스(WT)와 내성 바이러스(H275Y)의 뉴라미니데이즈의 결합력 비교 (B) 선별된 항체와 다른 단백질과의 결합력 비교 (C) 일반 뉴라미니데이즈와 (D)H275Y-뉴라미니데이즈 변이에 대한 선별된 항체 간 결합자유에너지 모델링 분석결과

 

인플루엔자 바이러스 감염 치료제인 타미플루는 뉴라미니데이즈 효소의 저해제로 작용하여, 증식된 바이러스를 세포 밖으로 배출하는 과정을 방해함으로써 바이러스 감염을 억제합니다. 그러나 뉴라미니데이즈에 변이가 발생하면 타미플루가 뉴라미니데이즈를 억제하는 기능이 떨어지게 되는데요. 따라서 타미플루 수요의 급증으로 인한 뉴라미니데이즈 변이 바이러스 유행을 예방하기 위해 약물 내성 바이러스를 신속하고 효과적으로 진단하는 기술의 개발이 요구 됩니다.

 

타미플루 감수성 바이러스*와 타미플루 내성 바이러스의 뉴라미니데이즈 표면 구조는 유사한 것으로 알려져 표적 단백질의 특정 구조를 인식하는 검출용 항체 개발에 많은 어려움이 있었습니다. 따라서, 기존 진단법은 돌연변이 된 하나의 아미노산의 유전자를 검출하는 기술에 집중되어 있으나, 이는 검체 확보에서 진단까지 오랜 시간이 걸리는 문제가 있었다고 합니다.

* 타미플루 감수성 바이러스: 항바이러스제인 Oseltamivir(상품명: 타미플루)에 치료 효과가 있는 A/H1N1형 인플루엔자 바이러스 

그림 2.    (A) H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스 농도별 도트 블롯 분석결과 (B)선별된 항체와 뉴라미니데이즈 변이 종류별 ELISA 결과 (C) 선별된 항체로 표면을 개질시킨 금 나노 입자와 바이러스 간 결합으로 인한 변색을 통한 비색 분석 결과  (D) 면역진단 래피드 키트에서의 검출 결과 (선별된 항체와 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 간 특이적 결합성 확인)
그림 2. (A) H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스 농도별 도트 블롯 분석결과 (B)선별된 항체와 뉴라미니데이즈 변이 종류별 ELISA 결과 (C) 선별된 항체로 표면을 개질시킨 금 나노 입자와 바이러스 간 결합으로 인한 변색을 통한 비색 분석 결과 (D) 면역진단 래피드 키트에서의 검출 결과 (선별된 항체와 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 간 특이적 결합성 확인)

 

이러한 문제점을 해결하기 위해 연구팀은 타미플루 내성 바이러스에서 주로 발견되는 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고 특이적 결합성을 검증한 뒤 SERS 기반 면역검출법에 적용했습니다. 그 결과 저농도의 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스를 직접 검출할 수 있었고, 인간 비인두흡입물 내에서도 변이 바이러스의 검출에 성공했습니다.

그림 3.   (A) 선별된 항체를 적용한 SERS 면역검출법의 모식도 (B) H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스 농도별 SERS 신호 변화 (C) 선별된 항체에 대한 일반 뉴라미니데이즈 바이러스와  H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스의 SERS 신호 변화 (SERS 면역분석법으로 기존의 면역검출법보다 10,000배 이상 적은 농도에서도 내성바이러스를 검출)
그림 3. (A) 선별된 항체를 적용한 SERS 면역검출법의 모식도 (B) H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스 농도별 SERS 신호 변화 (C) 선별된 항체에 대한 일반 뉴라미니데이즈 바이러스와 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스의 SERS 신호 변화 (SERS 면역분석법으로 기존의 면역검출법보다 10,000배 이상 적은 농도에서도 내성바이러스를 검출)

연구팀은 발굴된 항체로 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 항원에 대한 결합력 측정, 구조적 모델링 연구, 금 나노입자의 기반 비색 검출, 면역진단 래피드 키트 등을 통하여 이 항체가 타미플루 내성 바이러스 변이에 상대적으로 높은 결합력을 가짐을 확인했습니다. 또한, 선별한 항체를 금나노판에 부착하고 SERS 기반 면역검출법의 적용을 통해 100 PFU/ml의 저농도에서도 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스를 검출하였고, 바이러스 진단의 주요 검체로 쓰이는 비인두흡입물 안에서도 변이 바이러스 검출에 성공했습니다.

그림 4.   (A) SERS 면역 검출법을 이용하여 인간비인두흡입물과 타미플루 내성바이러스 혼합액에서의 바이러스 검출 모식도  (B, C) SERS면역 검출법을 이용하여  9개의 인간 비인두흡입물 검체 모두에서 타미플루 내성 바이러스를 효율적으로 검출하는 데 성공 함
그림 4. (A) SERS 면역 검출법을 이용하여 인간비인두흡입물과 타미플루 내성바이러스 혼합액에서의 바이러스 검출 모식도 (B, C) SERS면역 검출법을 이용하여 9개의 인간 비인두흡입물 검체 모두에서 타미플루 내성 바이러스를 효율적으로 검출하는 데 성공 함

 

연구책임자인 정주연 박사는 “이번 SERS 면역 분석법을 통한 연구 성과는 기존 유전자 검사에 의존한 항바이러스제 내성 바이러스 진단법과 비교하여 약물 내성 신종플루 바이러스의 감염 여부를 신속하고 간단하게 진단할 수 있는 기술로 다양한 현장에 활용 가능하다”며, “선별된 항체와 기존 연구에서 발굴된 화합물을 진단에 활용하기 위한 새로운 바이오수용체로 조립하고 다양한 면역분석법에 적용하여 초고감도 검출법 개발을 위한 후속연구를 진행하고 있다.”고 밝혔습니다.

 

용어설명

1. 타미플루 내성 바이러스 (Tamiflu resistant virus)

항바이러스제 (타미플루)의 광범위한 사용으로 인하여 출현된 변이주로 타미플루 표적 단백질인 뉴라미니데이즈의 275번째 아미노산이 히스티딘(Histidine; H)에서 티로신(Tyrosine; Y)으로 변이된 인플루엔자 바이러스이다. 뉴라미니데이즈의 변이에 의하여 타미플루 약효에 내성을 보인다.      

2. 현장진단시스템 (Point-of-care testing) 

환자가 처치(care)받는 위치와 근접한 곳에서 실시하는 검사로 피검자(환자) 가까이에서 원심분리 등 검체 전 처치 없이 신속하게 시행하여 진단 및 치료에 이용할 수 있는 검사이다. 

3. 체외진단 

혈액, 분뇨, 체액, 침 등 인체에서 유래한 물질을 이용해 몸 밖에서 신속하게 병을 진단하는 기술이다. 기존에 내시경 검사나 조직 검사 등으로 직접 확인해야 했던 질병을 보다 신속하고 간편하게 진단할 수 있는 장점이 있다.

4. 면역 진단

항원-항체 반응에 기초한 진단법으로 병원체에 특이적 항원 혹은 항체를 효소면역 검정법, 형광면역 검정법, 스핀면역 검정법 등을 통해 병원체를 진단하는 기술이다. 

5. 분자 진단

체외진단 기법 중 하나로 인체나 바이러스 등의 유전자 정보를 담고 있는 DNA 의 분자 수준 변화를 검출해 질병 등을 진단하는 기술이다. 

6. 비색 분석 (Coloriemtric analysis) 

색 시약을 이용하여 빛의 특정 파장의 흡광도를 측정하여 화학 화합물, 용액의 농도를 테스트하거나 정량하는데 사용한다. 유기 화합물과 무기화합물 둘 다에서 사용될 수 있다. 

7. H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스

타미플루 표적 단백질인 뉴라미니데이즈의 275번째 아미노산이 히스티딘(Hystidine; H)에서 티로신(Tyrosine;Y)으로 변이된 인플루엔자 바이러스

 

연구배경

  • 세계보건기구(WHO) 보고에 의하면 최근 항바이러스제의 광범위한 사용으로 인하여 항바이러스제에 내성을 보이는 바이러스의 출현이 증가하고 있다. 특히, 2012년 약물 내성에 대한 증거를 갖는 A/H1N1형 바이러스 중 오셀타미비르 (상품명: 타미플루) 대해 내성을 보이는 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스가 보고되었다. 
  • 대표적인 타미플루 내성 바이러스 중 하나인 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스는 바이러스 표면에 있는 뉴라미니데이즈(Neuraminidase)단백질의 아미노산 하나가 변형된 돌연변이를 말한다.
  • 뉴라미니다아제 억제제는 뉴라미니다아제의 작용을 방해하여 바이러스의 확산을 방지하는 약이기 때문에 뉴라미니데이즈에 변이가 발생하면 타미플루 약효가 떨어지게 된다. 
  • 감수성 바이러스와 내성 바이러스의 뉴라미니데이즈 표면 구조는 유사한 것으로 알려져 있어, 표적 단백질의 특정 구조를 인식하여 검출하는 검출용 항체 개발에 많은 어려움이 있다. 
  • 따라서, 기존의 약물 내성 바이러스 진단법은 하나의 아미노산 돌연변이를 검출하기 위한 유전자 검사 기술에 집중되어 있어 분석 시간이 길고, 숙련된 전문 인력과 고가의 분석 장비가 추가적으로 필요하기 때문에 다양한 현장에서 활용하기에는 어려움이 있다. 
  • 항바이러스제로 바이러스 감염력을 억제할 수 없는 뉴라미니데이즈 변이 바이러스를 신속하고 효과적으로 분류하여 약물 내성 바이러스 감염의 유행을 예방할 수 있는 고효율 진단 기술 개발이 요구된다.

 

연구내용

  • 이 연구에서 연구팀은 약물 내성 신종플루 바이러스 중 가장 큰 비중을 차지하는 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스에 특이적으로 검출할 수 있는 신규 항체를 개발하였다. 타미플루 내성 바이러스 표면의 변형된 뉴라미니데이즈 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였고, 그 결합력 측정과 모델링 분석을 통하여 이 신규 항체가 약물 내성 바이러스에 매우 높은 결합력을 가짐을 확인하였다. 
  • 이 항체를 금 나노 입자의 표면에 개질시켜 H275Y-뉴라미니데이즈 변이 바이러스와의 결합할 때 생기는 응집 현상을 비색 분석해서 그 결합 특이성을 확인하였고, 이 항체를 면역진단 래피드 키트에도 적용하여 타미플루 내성 바이러스 결합 여부를 다시 확인 후 이 항체의 결합 특이성을 검증하였다.
  • 특히, 이 항체를 SERS 기반 면역검출법에 적용하여 기존의 면역검출방식과 비교하여 10,000배 이상의 적은 농도의 타미플루 내성 바이러스를 신속하고 간단하게 검출하였고, 신종플루 진단의 체외진단 검체로 쓰이는 인간 비인두흡입물과 타미플루 내성 바이러스 혼합물에서도 타미플루 내성 바이러스를 특이성 있게 검출하는 데 성공하였다.
  • 본 연구진이 발굴한 항체의 SERS 기반 면역 분석법으로의 적용은 약물내성 바이러스를 간편하게 고감도로 검출할 수 있게 하고, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 효과적인 진단법을 개발하는 데 도움이 될 수 있다.
  • 즉, 본 연구성과는 기존 분자 진단 기반의 내성 바이러스 진단법과 비교하여 타미플루 내성 바이러스의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있어 다양한 현장에서 활용 가능할 것으로 기대된다.


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